涉及的三个基本概念
基线（Baseline）
在PCR 扩增反应的最初几个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即是基线。一般来讲，第3-15 个循环的荧光值就是基线。
荧光阈值（Threshold）
阈值一般是基线的荧光信号标准差的10 倍，荧光阈值设定在PCR 扩增的指数期。
CT 值（Ct value）
Ct 值表示的是每个PCR 反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
相同模板在同一台PCR 仪上相同条件下重复96 次扩增的扩增曲线图可以看出终点处检
测产物量不恒定，但是Ct 值则极具重现性（Fig.2）。
研究表明，各模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值就越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数（绝对量）的的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数（绝对量）的对数，纵坐标代表Ct 值。因此，只要获得未知样品Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数（绝对量）。
Real-Time qPCR 检测方法
荧光定量PCR 所使用的荧光化学染料可以分为两大类：荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR Green I 为主要代表，是一种非特异性荧光化学染料；而荧光探针包括Taqman、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等几种，属于特异性荧光染料。睿博兴科公司主要提供目前使用较多的SYBR Green I 荧光染料法和Taqman probe 法。
非特异性荧光染料SYBR Green I 法简介
SYBR Green I 是一种能够与双链DNA 小沟结合的染料。没有与双链DNA 结合时其荧光信号很弱，当其与双链DNA 结合后荧光信号大大增强并能够被仪器检测（Fig.4）。SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，它能够与体系中所有的双链DNA相结合，无需为不同的模板特殊定制，价格相对较低；缺点在于它能够和所有双链DNA 分子相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的精确性。
特异性荧光探针Taqman probe 法简介
Taqman 探针法是在PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET 反应；PCR 扩增时，Taq 酶的5’3’的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。
Real-Time qPCR 技术服务
技术服务实验平台
ABI 7500
技术服务项目
相对定量
一般用于基因表达研究，相对定量法必须对样品的目的基因和内参基因同时分别进行定量，然后得出对于内参基因的目的基因的相对量。通过比较样品中目的基因反转录之后的DNA 的量来研究不同样品间的mRNA 表达量情况。内参基因通常选用β-actin或GAPDH。通过同时对内参基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同或者提取RNA 的效率不同造成的RNA 量误差进行校正，在严格意义上实现对RNA 表达量的解析。
本公司采用SYBR Green I 法和Taqman 探针法两种方式，一般采用2-ΔΔCt 法进行计算，提供包括RNA 提取、反转录和扩增一条龙的服务！
绝对定量
绝对定量需要构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品，使用已知浓度（拷贝数）的标准品制作标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量或者起始拷贝数的分析。
定性分析
PCR 反应结束后，PCR 产物无需电泳检测，可以通过荧光定量PCR 方法，简单快速的对目的基因进行高特异性、高灵敏度的检测；同时闭管操作可以有效防止反应产物的污染。广泛应用于致病微生物检测、微生物品种鉴定以及基因型（SNPs）解析等方面。
提供样品类别及要求
样品的基因类别：DNA、mRNA、miRNA；
物种类别有人、鼠、鸡、牧草、酵母菌、金黄色葡萄菌、病毒上清液等等。
提供样品量要求： 细胞 ≥ 106 组织 ≥ 300mg 血液 ≥ 1ml 叶片等样品材料 ≥ 100mg
基因组DNA 或总RNA 体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl
NOTE：病毒，病原菌等致病微生物样品送样前必须灭活！
提供的结果内容
引物和探针及序列，待测基因序列或基因名称。
样本处理：
包括：定量（ng/ul）； A260、A280、A260/A280
琼脂糖凝胶电泳图；
预实验
引物及引物浓度、退火温度、等条件；胶图
若需要做标准曲线：标准品准备及调试
定量试验
扩增曲线、融解曲线（SYBR Green I 法）、原始数据、标准曲线（绝对定量）、相对定量结果的柱状图
测序合成基因工程 
